Estudio de la cinética de la fermentación in vitro y del residuo no fermentado del forraje disponible en la pradera y del aparentemente consumido por vacas lecheras (página 2)

Material y métodos

El experimento fue llevado a cabo en el Laboratorio de
Nutrición
Animal del NRI (Natural Resources Institute), en Wye, Kent, Gran
Bretaña, desde enero a febrero de 1996.

Alimentos. Se tomaron muestras de forraje de una pradera
permanente compuesta principalmente de gramíneas perennes
(Lolium perenne). La pradera fue manejada a dos alturas de
pastoreo (altura de pradera baja (PB) y altura de pradera alta
(PA)), bajo un sistema de
pastoreo continuo controlado. Además, se estudió el
forraje disponible (FD) en la pradera desde el suelo y el
forraje aparentemente consumido (FA) por el animal en pastoreo,
ambos a las dos alturas de pradera (cuadro 1). El FA se obtuvo
cortando y colectando el forraje inmediatamente adyacente a aquel
forraje consumido por el animal en pastoreo. Este proceso de
selección del forraje se realizó
siguiendo a siete vacas por cada altura de pradera. Las muestras
compuestas fueron secadas a 60º C en un estufa con
circulación de aire por 48
horas, y luego se molieron en un molino de cuchillos con una
criba de 1 mm. Las determinaciones realizadas en todas las
muestras de forraje fueron materia seca
(MS), proteína cruda (PC) y cenizas totales (CT) (A.O.A.C.
1980), fibra detergente neutro (FDN) y fibra detergente
ácido (FDA) (Goering y Van Soest, 1970) y celulasa neutro
detergente (CND) (Jewell et al. 1986), para determinar la
energía metabolizable (EM) según M.A.F.F.
(1993).

Dos ovinos canulados ruminalmente fueron usados para
suplir de líquido ruminal. Los animales
recibieron una ración de heno de pradera permanente y un
concentrado comercial (220 g PC/kg MS y 13,2 MJ / kg MS) en una
proporción aproximada de 3:1. Las raciones fueron
calculadas para lograr un consumo diario
de 1.0 a 1.5 veces el nivel de mantenimiento
(AFRC, 1993). Los alimentos se
ofrecieron en dos raciones iguales durante el día. Los
animales disponían de libre acceso al agua.

La técnica de producción de gas fue realizada
usando 1 g de sustrato (± 0.002 g) (base seca) por
tratamiento y en triplicado. Cada muestra fue
fermentada en forma independiente.

Preparación de las botellas. El medio
Theodorou fue preparado de acuerdo a un protocolo de
producción de gas NRI 1996. El medio se hirvió y
luego se enfrió y se gasificó con CO2.
El medio Theodorou (90 ml) fue puesto en botellas con capacidad
de 125 ml, bajo continua gasificación con CO2.
Una vez llenas, éstas fueron selladas con tapas de goma y
luego almacenadas a 4º C por 60 horas. Posteriormente, los
sustratos a incubar fueron transferidos a las botellas que
contenían el medio. Estas se gasificaron con
CO2 y fueron selladas nuevamente con tapón de
goma, y puestas a incubar a 4º C por 10 horas, para
posteriormente pasar a temperatura de
incubación de 39º C.

La inoculación. El fluido ruminal se
obtuvo de dos ovejas usando una bomba aspiradora y guardado en
termos a temperatura de 39º C. El líquido ruminal fue
filtrado a través de 4 capas de muselina y se
almacenó bajo una atmósfera de
CO2.

Inoculación de las botellas. Mientras el
inóculo estaba siendo preparado, las botellas cerradas
fueron ajustadas a la presión
atmosférica. Posteriormente, se inyectaron 10 ml de
inóculo a cada botella mediante una jeringa. Luego las
botellas fueron agitadas y devueltas a la estufa de
incubación a 39º C, momento que se consideró
como el comienzo del experimento (tiempo cero =
0). Las lecturas fueron llevadas a cabo a los siguientes tiempos,
después del tiempo cero: 3, 6, 9, 12, 15, 21, 27, 33, 39,
48, 60, 72 y 96 h.

Cuadro 1 .
Composición química (base materia
seca) de muestras de forraje disponible (FD) a ras del suelo y
del forraje aparentemente (FA) consumido, obtenidas a dos
alturas, baja (PB) y alta (PA), (g/kg. MS).

Chemical composition of herbage samples
offered at ground level (FD) and simulated grazing samples (FA),
at two sward height, low (PB) and height (PA) (g/kg.,
DM).

Registro de producción de gas.
Se utilizó un transductor de presión (Bailey
y Mackey Ltd., Birmingham 342 1 DE, UK) para medir la
presión dentro de las botellas. El transductor tuvo un
rango de presión de 0 a 25 psi (± 0.1) y las
lecturas fueron registradas en unidades psi. En cada tiempo de
lectura, se
retiraron las botellas desde el incubador, y se insertó
una aguja de jeringa desechable conectada al transductor a
través de la tapa de goma de la botella. La presión
de gas fue leída en el transductor y se extrajo el
volumen de gas
producido hasta ajustar a la presión atmosférica
(0.0 psi). Las botellas fueron agitadas y devueltas al
incubador.

La desaparición de la materia seca (DHS) fue
determinada a las 96 horas de incubación (final del
ensayo de
producción de gas) (DMS96). Los contenidos de cada botella
fueron aspirados y filtrados a través de filtros medidos
(goosh, vidrio cinta,
porosidad 1 – graduado P160). La botella fue lavada con agua
destilada y los residuos obtenidos fueron lavados en el filtro.
Los filtros de vidrio fueron puestos a la estufa durante la noche
a 105º C y luego dejados enfriar en un desecador y pesados.
La desaparición de la materia seca fue expresada como una
proporción de la materia seca inicial.

Análisis estadístico. Los
datos de
producción acumulada de gas (PAG) fueron corregidos a 1 g
de materia seca. La cinética de producción de gas
(desde las 12 horas de incubación) fue descrita
ajustándose a la ecuación exponencial y = a+b
(1-exp (-ct)), (Orskov y McDonald, 1979), donde:

y = gas producido al tiempo t
a = es intercepto de la función
b = gas producido en el tiempo infinito de incubación
c = tasa fraccional de cambio en
producción de gas

La PAG después de 12, 21,27, 48 y 96 horas fue
usada para la comparación entre sustratos. Se
realizó un análisis de varianza en un diseño
completamente al azar, con un arreglo factorial de 2 x 2,
considerando tipo de muestra de forraje obtenido (FD y FA) y
altura de pradera (PA y PB), para evaluar si existían
diferencias en la cinética degradativa usando la
técnica in vitro de producción de gas. Estos
análisis se realizaron utilizando el programa
estadístico Genstat (1987).

Resultados

La composición nutritiva de los forrajes en
estudio se presenta en la cuadro 1. Las muestras de FD a ras
suelo mostraron concentraciones mayores de FDN y FDA y menores de
proteína cruda que en el forraje aparentemente consumido.
Estos valores no se
compararon estadísticamente, por carecerse de repeticiones
(muestras compuestas).

Los volúmenes de gas acumulado en diferentes
tiempos para los forrajes son presentados en la cuadro 2. Se
observa para todos los tiempos de incubación una mayor
producción de gas en el FD a ras del suelo que en el FA
consumido por el animal, la cual sólo fue significativa
sólo hasta las 27 horas (P<0.05). Esta mayor
producción de gas acumulada indica que el FD fermenta
más rápidamente que el FA consumido. Sin embargo, a
partir de las 27 horas (cuadro 2) de incubación no hubo
diferencias significativas entre los forrajes estudiados
(P>0.05), en producción de gas acumulado ni en la tasa
de fermentación en el período total
(cuadro 3). La altura de la pradera no tuvo efecto sobre los
parámetros estudiados (P>0.05).

El cuadro 3 muestra que la desaparición de
materia seca in vitro después de 96 horas de
incubación fue mayor para el FA consumido (P<0.001),
pero no hubo diferencias en la producción acumulada de gas
(P>0.05).

Discusión

El bovino en pastoreo selecciona una dieta que contiene
una mayor proporción de hojas verdes y una menor
proporción de tallos y material muerto, en relación
al que se encuentra disponible en el forraje total (Hodgson,
1990). Este proceso selectivo aparecería evidenciado en
las muestras de los forrajes en estudio (FD y FA), indicando a la
vez que la selección del FA consumido por los bovinos fue
adecuada.

La tasa y extensión de la fermentación de
un sustrato puede ser determinada midiendo la producción
de gas acumulada y el volumen de gas que refleja la
producción de ácidos
grasos volátiles y la producción de CO2 y CH4
(Kibon y Orskov, 1993). Se ha demostrado (Blümmel y Orskov,
1993; Blümmel y Bullerdieck, 1997), que la proporcionalidad
de los ácidos grasos volátiles en el gas fermentado
influye sobre el de volumen de gas producido, ya que sólo
la fermentación de acetato y butirato produce CO2 y
posteriormente metano. Este
comportamiento
(cuadro 2) podría observarse hasta las 27 horas de
incubación en este trabajo al
comparar la producción de gas acumulada del FD y del FA.
Prasad y col. (1994) agregan que la producción de gas
después de 12 horas de incubación es un indicador
de fermentación inicial y después de 52 horas es un
indicador de extensión de fermentación in
vivo.

Cuadro 2
Valores observados de producción acumulada de gas (ml /g
MS) a diferentes tiempos de incubación (PAG), de muestras
de forraje disponible (FD) a ras de suelo y de forraje
aparentemente (FA) consumido, a dos alturas, baja (PB) y alta
(PA).
Cumulative gas production (ml/g DM) for forages samples of
herbage mass (FD) and simulated grazing samples (FA), at two
sward height, low (PB) and high (PA).

PA = Altura de pradera
alta;   PB = altura de pradera baja.
s.e.d. = Error estándar de la diferencia entre dos
promedios.
** : (P<0.01);  NS= no significativo.

Cuadro 3
Degradabilidad de la
materia seca in vitro (DMS96), a las 96 horas (g/kg. MS) y
los indicadores de
la tasa y extensión de la producción de gas de
forraje disponible (FD) a ras del suelo y del forraje
aparentemente (FA) consumido, obtenidas a dos alturas, baja (PB)
y alta (PA).
In vitro dry matter disappearance (DMS96) at 96 hours (g/kg.
DM) and indicators of extent and rate of gas production for
forages samples of herbage mass (FD) and simulated grazing
samples (FA) at two sward height, low (PB) and high
(PA).

PA = Altura de pradera alta;  
PB = altura de pradera baja.
s.e.d. = Error estándar de la diferencia entre dos
promedios.
*** : (P<0.001);  NS= no significativo.

En este experimento, probablemente la menor
producción de gas en el FA consumido (cuadro 2)
podría haber sido resultado de una mayor cantidad de
sustrato fermentable capaz de producir ácido
propiónico y por lo tanto una menor producción de
gas, concordando con lo señalado por Blümmel y
Orskov, (1993), ya que estas mismas muestras de forraje mostraron
mayores valores de degradabilidad inicial in vivo (Pulido, 1997).
Además, Blümmel y col. (1994) señalaron que en
un tiempo de incubación de 24 horas todo el sustrato
celular soluble debería estar fermentado. Asimismo, Menke
y col. (1979) indicaron que la producción de gas reflejaba
más el contenido de carbohidratos
digeribles que los de proteína y grasa digeribles. Por lo
tanto, el volumen de gas producido refleja la fermentación
del sustrato hacia la formación de ácidos grasos
volátiles y así participa como un estimador de la
digestibilidad aparente en el rumen (Blümmel y Orskov,
1993).

A partir de las 27 horas de incubación no hubo
diferencias en producción de gas acumulado entre los
forrajes estudiados (cuadro 3). Por lo tanto, es posible suponer
que a partir de esta hora de incubación la estequiometría de la fermentación
tomó vías similares para los sustratos en estudio.
Además, Blümmel y Orskov (1993) indican que las
fermentaciones secundarias producto de la
fermentación de las bacterias
muertas y desechos celulares podrían ser una fuente de
error en el análisis de producción in vitro de
gas.

La mayor desaparición de materia seca
después de 96 horas de incubación para el FA
consumido (cuadro 3) coincide con la desaparición de
materia seca in vivo a las 72 horas para las mismas muestras
(Pulido, 1997) y con lo expuesto anteriormente en relación
a la estequiometría de la fermentación. Por lo
tanto, sustratos con diferentes composiciones pueden tener
diferentes características de fermentación in
vitro, dependiendo de si ellos son medidos en base a
producción de gas o desaparición de materia seca
(Sampath y col., 1995). La correcta interpretación de las relaciones observadas
entre tasa de producción de gas y tasas de
desaparición del sustrato (tasa de degradabilidad)
requiere la elaboración de balances
estequiométricos que permitan asociarla producción
de gas con los compuestos
orgánicos (Pichard, Troncoso y Bruni, 1995). Entonces,
es posible esperar que la desaparición de materia seca
indicaría cuánto de sustrato estuvo disponible para
la fermentación y la producción acumulada de gas, y
de cómo este sustrato fue usado para la producción
de gas (Blümmel y Orskov, 1993).

La técnica in vitro de producción de gas
parece ser una herramienta útil para estudiar las
características de degradabilidad ruminal de la materia
seca en el ID en la pradera y el FA consumido. Sin embargo, la
asociación, ya sea con el estudio estequiométrico
de los gases
producidos, y/o de la desaparición de la materia seca a un
tiempo definido, posibilitarían una mejor
comprensión de la utilización del sustrato a nivel
ruminal.

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1 Instituto de Zootecnia, Facultad de
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2 Natural Resources Institute, Central
Avenue, Chatham Maritime, Kent ME4 4TB, U.K.

3 Wye College, University of London, Wye,
Ashford, Kent TN25 5AH, U.K.